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当前位置: 首页 > 在线留言 > 【求助】 小鼠肝细胞培养 用的gibco产品仍做不出来
公司介绍
美国Worthington Biochemical Corporation成立于1947年,位于美国东海岸美丽海滨小城Lakewood, 有超过60年的生产经营历史,是世界上最主要的酶类供应商,是细胞分离酶的专家级公司。同时,也提供DNA/RNA纯化等分子生物学方面的产品。Worthington已经被购买和出售了好几次,并于1987年返回到沃辛顿家族。60年来,Worthington一直保持世界上高纯度酶的主要来源。
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  • question 细胞分离时遇到一些问题,主要是实验结果不稳定,请教高手。

    我的操作如下:

    1.WarmuptheLiverDigestSolutionandLiverPerfusionBufferin37Cwaterbath,

    2.Setupthepumpattheposition14,

    3.Flushthepumpwith70%ethanol,

    4.FlushthepumpwithLiverPerfusionBufferfor5min,

    5.Anaesthetizethemousewithavertin,

    6.Cannulatetheportalveinandtightsuturearoundcatheter,oneplaceisjustatcannulateentering,
    anotherisatalittlebitlowerYforkofportalvein.

    #6.Openthechest,findoutIVC,tightsutureattheIVCsegmentinchest.

    7.Connecttothepumprunningattheminimalrate,

    8.Turnupthepumptotheposition14andperfusetheliverwiththeLiverPerfusionBuffer
    for4~5minuntiltheliverturnspale,

    9.DigestinsituwithLiverDigestSolutionuntilliverlookslikeabagofloosecells,
    about10~15min,

    10.RemovethelivertodishonicecontainingafewmlsofHepatocyteWashMediumswith
    5mlofP/Spriortouseandcuttheliverintopieces.

    11.PourthesUSPensionthroughsterilemesh,

    12.Spinitdownat50g(~483rpm)5minat4C,[CentrifugeSORVALLRT6000D]

    13.WashthepelletwiththeHepatocyteWashMediumstwomoretimes,

    14.Resuspendthepelletin25mlPBSandadd25mlPercollsolution(45mlpercoll+5ml
    10PBS+100lof1MHepes).Spinat115g(~733rpm)5minat4C,

    15.Resuspendthepelletinthe10%FBSDMEMwith1P/Smediumandcountthecells,

    16.Platecellsatthecelldensityof2106/wellinthe6welldishes.

    每一步都能看到沉淀,但是有时看着消化的很好的肝脏,却在加percoll离心时管底没细胞,全在上面,请教大侠,我的问题可能是:
    125mlPBSandadd25mlPercollsolution(45mlpercoll+5ml
    10PBS+100lof1MHepes).里的percollsolution配得有问题或者与PBS的比例错误?
    2消化液在37度孵育时间过长,胶原酶失活了?(看着灌注完效果很好啊)
    3是否存在消化过度的问题?

    真是很郁闷,盼高手指点!

    请添加标题分类标记【求助】,这次先补上,谢谢您支持!">【求助】 小鼠肝细胞培养 用的gibco产品仍做不出来

    • answer 我也在做原代肝细胞,跟你的操作基本差不多。percoll solution配制比例和你一样,PBS的比例也一样,我想应该不是这个问题。
        我想你加percoll 离心后管底没细胞,可能是你消化过了,细胞可能死了或成了碎片,所以全浮在上面。你可以请你们那儿做过这方面工作的帮你指导一下消化到什么程度才是适度。希望你尽快找出原因,以后大家多交流
    • answer 楼上的,楼主的步骤中第11步就已经过筛网了啊。我的也是先用70um筛网过筛,用PBS洗两次之后再用90%Percoll solution 离心的,效果还可以。
    • answer 用30%Percoll solution 试试,另外,在步骤14之前,你怎么没有用200目的筛网过滤细胞?
    • 收起
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